用P11柱一步纯化色氨酸阻遏蛋白质

利用携带有克隆色氨酸阻遏蛋白基因的pJPR2质粒的大肠杆菌菌株,经过细菌培养、扩增及一系列生化方法,得到色氨酸阻遏蛋白的粗品,然后利用磷酸纤维素P11柱分离纯化得到单一的色氨酸阻遏蛋白,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定和pRK9质粒中trpP/O片段保护实验证明,分离到的色氨酸阻遏蛋白是纯的,并具有生物活性。该方法和思维的建立,为研究核酸结合蛋白质的结构与功能提供了基础。     

大肠杆菌JM105的转化及快速鉴定

用CaCL_2处理JM105空白的大肠杆菌,使之成为感受态细菌,然后将含白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的cDNA的质粒PGEM-72f~(( ))转化到感受态细菌中去,涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基中,培养过夜,挑取生长良好的单菌落,再接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中,培养过夜,用溶菌酶法裂解细菌细胞壁,用0.8％。琼脂糖凝胶电泳检测质粒,在紫外反射透射仪上观察结果。此方法简便,快速,不需特殊设备及试剂。     

硅藻DNA片段在表达质粒pMZR中再克隆的研究

用部分酶切法切开表达质粒 pMZR 中一个 HindⅢ位点后,插入了一个带 HindⅢ粘性末端的1kb 硅藻 DNA 片段重组 DNA 分子转化 E.coli LE392,对转化子中的重组 DNA 分子用酶切分析后,鉴定了1kb DNA 片段插入 pMZR 的位置。     

猪β干扰素基因17位丝氨酸突变体重组酵母表达载体的构建

根据猪β干扰素基因序列设计一对引物,并按酵母密码子的偏好性,在引物中对稀有密码子进行同义突变,即第3位的TAT基因突变为TAC,第7位的CGA基因突变为AGA,第164位的CGG基因突变为CGT。同时,利用聚合酶链式反应基因定点突变技术,把17位的半胱氨酸密码子TGT突变为丝氨酸密码子TCT,构建poIFNβSer17...     

c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

为构建c-Jun氨基末端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase3,JNK3)的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环(activation-loop,A-loop)结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及p VP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到p VP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTMEL Transfection Reagent转染人胚肾(human emborynic kidney,HEK) 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3 (A-loop)结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功; p VP16-eGFP-MycJNK3 (A-loop)成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。     

利用反向PCR鉴定沼泽红假单胞菌中野生质粒

为准确研究沼泽红假单胞菌的野生质粒及其携带的基因信息,在常规碱裂解法基础上,对沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris AS1.2352中野生质粒提取方法进行了优化,优化方法具有易操作、耗时少、纯度高等特点,所得质粒DNA纯度和质量均满足进一步分子操作的需要.同时,利用反向PCR技术鉴定该野生质粒,并结合生物信息学方法对其进行分析,比传统的质粒丢失法验证和考察质粒更为省时、可靠和直观.证明菌株携带4个野生质粒,其中2.3 kb的质粒序列与Escherichia coli pEC157 Rom-like protein gene有97.8%的同源性,推测1885~1887碱基为复制起点.     

pDNA-巯基壳聚糖纳米粒的制备及Box-Behnken效应面法工艺优化

以巯基壳聚糖(TCS)为基因载体,采用离子交联法制备能用于基因口服研究的质粒DNA-巯基壳聚糖纳米粒(pDNA-TCS-NPs).分别以TCS质量浓度、三聚磷酸钠(TPP)质量浓度、pH值和转速为考察对象,以pDNA-TCS-NPs粒径和Zeta电位为评价指标,采用4因素3水平Box-Behnken 效应面法筛选最佳制备工艺,并对其外观形态,包封率等体外性质进行考察.结果表明:TCS质量浓度为0.80 mg·mL^-1,TPP质量浓度为0.65 mg·mL^-1,pH=5.3,转速为2 000 r·min^-1是最优制备工艺,可制得粒径为(134.21±1.34)nm,Zeta电位为(24.36±0.29)mV,包封率在(80.26±0.56)%,形状规则且分散良好的pDNA-巯基壳聚糖纳米粒;Box-Behnken 实验设计可用于预测和优化pDNA-TCS-NP制备工艺优化筛选.     

铜绿假单胞菌铁与群体感应系统的调节

目的分析总结铜绿假单胞菌铁调节机理及其与群体感应系统之间的调节关系。方法汇总实验室有关铁调节和群体感应系统的研究结果,并结合相关文献资料进行分析总结。结果铜绿假单胞菌可以通过多种途径吸收利用不同来源或状态的铁源,在各种铁吸收途径中以铁载体介导途径尤为重要。Fur蛋白作为调节中心,与小RNA和ECF sigma因子共同对铁平衡进行精巧调节,而铁调节和群体感应系统相互影响,共同调节着相关基因的表达。结论铜绿假单胞菌中铁和群体感应系统协同作用,形成一个复杂的全局性网络,调节菌体毒性因子的表达等多种生理过程,影响着细菌感染的进程。     

PCR法快速鉴定阳性克隆实验的改进

分析了常规PCR扩增鉴定阳性克隆实验中存在的问题,进行了改进探索:反转录PCR(RT-PCR)获得目的基因片段,TA克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌感受态细胞;利用目的基因的特异性引物,用菌液PCR法直接筛选重组克隆,在筛选的阳性菌液中扩增到与目的基因片段大小一致的阳性条带,与质粒PCR及酶切的阳性对照一致,验证了菌液PCR具有可靠性。实验证明,自身引物菌液PCR法用于定性筛选重组阳性克隆,是一种简便、快速、有效的方法。     

一株吡啶降解菌的生理生化特性研究

从活性污泥中筛选了一株能以吡啶为唯一碳、氮源的细菌,经鉴定为脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans W12）。W12菌具有壮观霉素和潮霉素抗性。降解实验结果表明,W12菌能够将505.4mg/L的高浓度吡啶在26小时内完全降解,但不具有降解苯酚和喹啉的能力。质粒提取实验结果显示,W12菌含有两个大质粒,消除质粒后菌株的吡啶降解能力明显低于野生菌,因此该菌株所携质粒可能与W12菌的吡啶降解能力有关。